①支原體檢測

     主細胞庫、工作細胞庫、病毒種子批、對照細胞以及臨床治療用細胞進行支原體檢查時,應同時進行培養法和指示細胞培養法(DNA染色法)。病毒類疫苗的病毒收獲液、原液采用培養法檢查支原體,必要時,亦可采用指示細胞培養法篩選培養基;也可采用經國家藥品檢定機構認可的其他方法。

    a. qPCR 法

     采用qPCR熒光探針法,通過特異性引物、探針(FAM標記)擴增檢測支原體基因組中16S rRNA編碼區,定性檢測樣本中支原體DNA,涵蓋了120多種支原體DNA序列;檢測快速,專一性強,性能可靠,參照EP 2.6.7和JP XVII支原體檢測相關要求進行驗證;用于主細胞庫、工作細胞庫、病毒種子庫以及臨床治療用細胞的檢測。
內部質控(IC,VIC標記)可在PCR擴增反應階段加入,以判斷待檢樣本對擴增反應是否存在抑制,防止假陰性結果的產生;也可在樣本提取階段加入,以評估提取效果。
采用磁珠法提取純化支原體DNA,高效提取樣本中的支原體DNA,確保檢測限可達到10 CFU/ml。
    NAT測試系統要求
        – 作為培養法的替代方法:NAT測試系統必須檢測到10CFU/mL
        – 作為指示細胞培養法的替代方法:NAT測試系統必須檢測到100CFU/mL
        – 內部質控IC(整個過程:提取、逆轉錄、擴增、檢測)
        – 外部質控(PC、NTC、NCS)

質控結果分析

Ct-PC

Ct-NTC

Ct-NCS

FAM

VIC

FAM

VIC

FAM

VIC

<40

<40

Ct40或無擴增

<40

Ct40或無擴增

<40

待測樣本檢測結果分析

FAM

VIC

結果判斷

Ct<40

<40

陽性

Ct40或無擴增

有抑制

Ct40或無擴增

Ct<40

陰性

Ct40或無擴增

有抑制


    b.培養法

    每支培養基接種供試品0.5ml-1.0ml,于特定環境下培養28天后觀察培養基的變化,與陰陽性對照培養基作比較。
培養基的選擇:支原體肉湯培養基,精氨酸支原體肉湯培養基,支原體肉湯半流體培養基(支原體肉湯瓊脂培養基),精氨酸支原體肉湯半流體培養基(精氨酸支原體肉湯瓊脂培養基),選取液體和半流體培養基或者液體和固體的培養基用于支原體的檢查。亦可使用其他培養基,但靈敏度必須符合要求。
培養基靈敏度檢查(變色單位試驗法):(1)菌株肺炎支原體(ATCC15531株)、口腔支原體(23714株,)由國家檢定機構分發。靈敏度為10cfu/ml,是藥典上最普遍的方法,不過檢測時間過長,操作過程也繁瑣,結果判定的有一定的人為因素。


    c.指示細胞法

   將供試品接于指示細胞(無污染的Vero細胞或經國家藥品檢定機構認可的其他細胞)中培養后,用特異熒光染料染色。如供試品污染支原體,在熒光顯微鏡下可見附在細胞表面的支原體DAN著色。靈敏度為100cfu/ml,中國藥典檢測支原體的另一種方法,時間大約也需要20天,容易污染,結果判定有也一定的人為因素。
結果判定:
    ⑴ 陰性對照:僅見指示細胞的細胞核呈現黃綠色熒光。
    ⑵ 陽性對照:熒光顯微鏡下除細胞外,可見大小不等、不規則的熒光著色顆粒。
    當陰性及陽性對照結果均成立時,試驗有效。



    d.法規

     EP9.0-2.6.7.支原體/JP17-支原體

    ②無菌檢測

    無菌檢查法系用于檢查藥典要求的無菌的藥品、生物制品、醫療器具、原料、輔料及其他品種是否無菌的一種方法。





    ③分枝桿菌檢測

    ④病毒檢測

     用哺乳類工程細胞生產的產品,包括臨床治療用細胞制品,根據ICH相關指導原則,不確定的病毒污染是一項重要的安全考量,可用in vitro方法來檢測。SHENTEK可為細胞庫,種子庫,原材料和終產品提供in virto檢測和客戶定制化檢測。
     In-vitro方法檢測內源或不確定的病毒。




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